常在細菌のDNAが病原細菌を殺す？
これは今年読んだ一番好きな論文12月5日の記事です．
https://adventar.org/calendars/4489
紹介する論文は
Commensal Neisseria Kill Neisseria gonorrhoeae through a DNA-Dependent Mechanism
です．https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.07.003
人の共生細菌Neisseria elongate（Nel）から放出されるDNAが淋病を引き起こす病原細菌Neisseria gonorrhoeae（Ngo）に対して毒性を示すという論文です．
まず遺伝子の水平伝播，細菌同士の戦い，制限修飾系による細菌の免疫システムについてです．
遺伝子の水平伝播は親から子へではなく，世代を介さない遺伝子の授受のことです．細菌は2分裂によって増えるので，新しい遺伝子を世代間で獲得していくということがほとんどありません．病原遺伝子や薬剤耐性遺伝子は遺伝子の水平伝播によって新たな病原細菌や薬剤耐性菌が生み出します．伝播経路にはウイルスによるもの，細菌同士の接触による遺伝子のやり取り，環境中の裸のDNAを取り込んで染色体に組み込むというものがあります．その他にもDNAをカプセルの中に入れて飛ばして，ほかの細菌がそれを取り込むという報告もあります．環境中には大量の裸のDNAがあるので，裸のDNAを取りこむという能力（以下ナチュラルコンピテンス）は生存に有利な遺伝子を獲得するのに非常に有効です．またDNAはそれ自体が栄養源にもなります．しかしナチュラルコンピテンスはすべての細菌で見つかっているわけではありません．ある程度限定された状態でのみナチュラルコンピテンスになるという細菌も多いです．今回紹介する論文の主役Neisseria 属菌は常にナチュラルコンピテンスです．4型繊毛というチューブを使って，裸のDNAを捕まえて，細胞内に取り込みます．Neisseria 属菌は特定の10-12塩基配列を含むDNAを効率よく取り込むことができます．
次に細菌同士の戦いについてです．細菌はあらゆる環境に生息しています．環境中で生存するために，なるべく似たような，同じ栄養を使ってしまう細菌を排除する必要があります．抗菌作用のあるタンパク質などの放出，生育に必要な栄養素の独占，分泌装置と呼ばれる針を使って敵の細菌に毒を直接注入することなどがあります．宿主の免疫機能を調整して，間接的に敵の細菌を排除することもあります．今回紹介する論文は細菌が放出するDNAが競合する細菌を殺すという報告です．
細菌にはバクテリオファージという厄介なウイルスが存在します．バクテリオファージは細菌に感染するウイルスで，細胞にDNAを注入し，細胞の中で増幅され，必要なたんぱく質を作って．細胞を壊して外界に出ていきます．バクテリオファージに対する免疫としてCRISPR-Casシステムや制限修飾系があります．CRISPR-Casシステムは獲得免疫のようなもので，細胞に侵入したDNAの配列を覚えておいて，その配列のDNAを見つけ次第壊すというものです．そして制限修飾系は自然免疫のようなものです．制限とは制限酵素のことで，修飾とはメチル化転移酵素のことです．DNAはA，T，G，Cの塩基からできています．制限酵素は特定の塩基配列（例えばHindIIIという制限酵素だと5‘-AAGCTT-3’という塩基配列）を切断します．メチル化転移酵素は同様の配列の塩基にメチル基をくっつけます．制限修飾系は制限酵素とメチル化転移酵素がセットになっています．メチル化された塩基配列は制限酵素による切断を受けなくなります．制限修飾系では自己のDNAをメチル化で制限酵素からの切断から保護することで，メチル化されていない非自己のDNAを選択的に切断できます．CRISPR-Casシステムと制限修飾系によって非自己のDNAが増えるのを防いでいます．その他の細菌のウイルス防御として非自己のDNAが増幅する前に自殺するという現象もあります．ファージに対する防御機構に細菌がcyclic GMP-AMPを介して自殺するという報告も最近ありました．制限修飾系の種類が多ければ多いほどいいと思いきや，今回の論文では制限修飾系の多さが仇になって，細菌との競争に負けてしまいます．
論文の紹介です．
Neisseria 属菌はヒトに対して病原性を持つ髄膜炎菌N. meningitidsや淋菌N. gonorrhoeae （Ngo）が有名です．一方で病原性を持たず，共生しているNeisseria 属菌もいます．N. elongate（Nel）は主に口腔内に生息している共生細菌の一種です．どちらもヒトの粘膜に定着します．
試験管でNgoとNelを共培養すると24時間後にNgoの菌数が検出限界以下になり，NelはNgoに対して毒性を持つことが分かりました．さらにNelを24時間培養した培養液からNelを取り除いた上清だけでもNgoに対して毒性を示しました．分泌装置などの菌体同士の接着を介した経路ではなく，何らかの分泌物による毒性であると考えられました．
Nelの培養上清をDNaseで処理したところ，Ngoに対する毒性は消失しました．プロテアーゼやRNaseでは毒性は消失しませんでした．Nelの培養上清からDNAを精製したものはNgoに対してDNAの用量依存性に毒性が増加しました．このことからNelの培養上清に存在するDNAがNgoに対して毒性を示すことが分かりました．
Ngoはナチュラルコンピテントなので，NelのDNAを取り込み，何かが起きて，細胞死が起きているのではないかと考えました．Ngoが環境中のDNAを捕まえるのに使う4型繊毛を構成するタンパク質の一つComPまたはPilTをコードする遺伝子を欠損させた菌株，
取り込んだDNAに結合し，組み換えを起こすRecAの発現をIPTGで制御することができる菌株を用意しました．ComPを発現しない菌株，IPTGでRecAを誘導しなかった菌株はNelのDNAに対して抵抗性を示しました．一方でComPまたはPliTを相補した株，RecAを誘導した株はNelのDNAに対して感受性を示しました．Ngoは4型繊毛を使ってDNAを取り込み，RecAを介した何らかの経路で細胞死が引き起こされているということが分かりました．
NelのDNAをランダムに裁断し，大腸菌の中でNelのDNAの一部 (20-50 kbp) を増やし，NelのDNAの一部を持つ大腸菌のDNAがNgoに対して毒性を示すのかを調べました．その結果Nelの一部のDNA配列を含む大腸菌のDNAはすべてNgoに対して毒性を示しました．したがってNelの特定の遺伝子領域，タンパク質による毒性ではないと考えられます．しかしながらランダムに裁断したNelのDNAのなかに共通に含まれる配列が存在します．それはDNA Uptake Sequence （DUS）です．
Neisseria 属菌にはDUSという10塩基（DUS10）またはDUS10の5‘末端に2塩基付け足された12塩基（DUS12）からなる配列を多く持ちます．Ngoの場合，1 kbpあたり1個 （DUS10）または0.7個（DUS12） です．DUSを含む配列はNeisseria 属菌の染色体に効率よく組み込まれます．NgoにおいてDUS12を含む遺伝子はDUS10を含む遺伝子よりもわずかに形質転換効率が高いです．
DUS12を大腸菌の中で増やし，DUS12を含む大腸菌のDNAとDUS12を含まない大腸菌のDNAのNgoに対する毒性を比べたところ，DUS12を含む大腸菌のDNAはNgoに対して高い毒性を示しました．したがってNgoに対してDNAが毒性を示すのは12塩基からなるDUS12が必要であることが分かりました．しかしながら先ほども述べたようにDUS12はNgoのゲノム上に非常に多く存在します．もちろんNgoから精製したDNAはNgoに対して毒性をあまり示しません．
Ngoに対して毒性を示すために必要なDUS12以外の要素についてNelとNgoのDNAのメチル化について注目しました．Ngoのゲノムは多くのメチル化モチーフを持ちます．一方でNelを含む共生性Neisseria 属菌はメチル化モチーフをあまり多く持ちません．メチル化モチーフの差がNgoに対する毒性に関係があるのかを調べました．メチル化転移酵素で処理したNelのDNAと未処理のDNAのNgoに対する毒性を比較したところ，メチル化処理したDNAはNgoに対する毒性が低下しました． Ngoまたはメチル化モチーフをほとんど持たない大腸菌でDUS12を含むNgoの遺伝子配列を増やし，同じ配列を精製したDNAのNgoに対する毒性を比較したところ，大腸菌から精製したDNAのみNgoに対して高い毒性を示しました．したがってDUS12を含みNgoと異なるメチル化モチーフを持っているDNAをNgoが4型繊毛を用いて細胞内に取り込み，RecAが関与する機構で細胞死が引き起こされることが分かりました．
論文中ではマウスの膣内でもNelとNgoの競合はNelが勝ち，またDNAの取り込み能力が関わっているというデータもあります．またNel以外の共生性Neisseria 属菌のDNAもNgoに対して毒性があること，髄膜炎菌N. meninngitidisに対してもNeisseria 属菌のDNAは毒性を示すデータもありました．論文は以上で終わりです．
淋菌Ngoの特徴として細胞表面の構造を頻繁に変えることで，ヒトの免疫から回避する能力を持ち，薬剤耐性菌も増えており，厄介な病原細菌です．DNAを使った対Ngoの対策があると面白いです．
Neisseria 属菌以外の菌だとどうなのでしょうか．今回のNeisseria 属菌のように同属の細菌のDNAが毒性をしめすというのはあるのでしょうか？ナチュラルコンピテントな細菌はたくさん存在するので探したらありそうです．
例えばこの論文（https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.09.083）ではAcinetobacter baylyi という細菌がDNAを取り込んだ際に細胞の伸長がおきるという報告をしています．A. baylyiもナチュラルコンピテンスな細菌です．この論文ではA. baylyi の6型分泌装置に関しての研究から始まっています．6型分泌装置を持つA. baylyiを大腸菌と共培養するとA. baylyi の細胞が伸長するという話から始まり，それが死んだ大腸菌から放出されたDNAの存在によって引き起こされること，RecAの発現量が上昇するという話になります．この現象はA. baylyi 自体のDNAによっても引き起こされます．そしてコンピテントなA. baylyiとコンピテントではないA. baylyiを大腸菌と共培養すると，コンピテントなA. baylyiの割合が低下していきます．
RecAというタンパク質はDNAと結合するタンパク質なのですが，これはSOS応答反応という現象に関わっています．SOS応答反応はDNAが損傷を受けた際に起こるDNAの修復反応です．DNA損傷により遊離したDNAがRecAと結合します．RecAはSOS応答反応を抑制しているタンパク質を分解して，SOS応答反応が進みます．DNAの修復中は細胞分裂が起こらないように制御されます．細胞分裂に関わるタンパク質が壊れたり，細胞がうまく分裂できなかったりして，細胞の形が変わったり，細胞の増殖速度が低下します．ナチュラルコンピテンスはDNAを取り込むと取り込んだDNAとRecAが結合して，SOS応答反応が起こることが知られています．おそらくA. baylyi でも同様のことが起きています．ただNeisseria 属菌にはRecAに関係するSOS応答反応がないので，いったい何が起きているのかは不明です．本当にRecAがDNAの相同組み換えを起こして，メチル化モチーフの違いによって染色体の損傷が起きて，細胞死につながっているのでしょうか．勉強不足でよくわからないことが多かったですが，この論文はきれいにストーリーがまとまってて面白かったです．
今年読んだ一番好きな論文2017 Advent Calendar 2017/12/5
初めまして．
細菌の病原性や生存戦略に興味があります．
いっぱい空きがあったので，参加させていただきました．
よろしくおねがいします．
2014年の論文と少し前の論文ですが，面白かった論文は
”A random six phase switch regulates pneumonoccal virulence via global epigenetic change"
です．
https://www.nature.com/articles/ncomms6055
というわけで論文の主役は
Streptococcus pneumoniae （肺炎球菌）
です．
肺炎球菌
- DNAが遺伝子の本体ちゃうんかという実験で使われた細菌
- 肺炎の原因菌として最も分離頻度の高い細菌
- 年間推定100万人の死亡に関与
- 多糖体でできた莢膜を保持
- 莢膜は白血球による貪食作用に対する抵抗性に関与
莢膜の発現に着目して，アベリー博士らによって遺伝子の本体の探索の実験が行われました．
この莢膜についてですが，同じ菌株でも莢膜をたくさん出すタイプとあまり出さないタイプが混在していることがわかっています．
肺炎球菌は呼吸器に感染，定着する際に菌体表面の分子が宿主細胞の受容体に結合します．上皮細胞への定着は莢膜が薄いほど，より接着性が高くなり，気道に定着しやすくなります．肺炎球菌が血流感染を起こした際は莢膜を多く産生し，好中球などの貪食から逃れます．肺炎球菌は感染部位によって病原性を変化させる相変異という巧みな生存戦略を保有しています．
今回紹介する論文は
肺炎球菌の相変異の分子メカニズムはDNAメチル化によって制御されている
というお話です．
DNAメチル化はDNAを構成するATGCの4塩基のうちAとCをメチル化させることによる複製のタイミングや転写などの調節に関与しています．細菌のDNAメチル化酵素には制限修飾系があります．制限修飾系は特定の塩基配列に特異的なエンドヌクレアーゼ，配列特異的なメチラーゼをコードする遺伝子から構成されます．メチル化された塩基はエンドヌクレアーゼによる切断を受けません．
自分の塩基配列はメチル化酵素によって保護し，外来遺伝子（バクテリオファージ）などのメチル化されていない塩基配列をエンドヌクレアーゼによって切断するという細菌の免疫に役立っています．
S. pneumoniae D39株 （アベリー博士の実験に用いられた菌株）のゲノムには制限修飾系がいくつかあります．
制限修飾系の一つ (SpnD39III) をFigure 1 に示してあります．
https://www.nature.com/articles/ncomms6055/figures/1
Figure 1
hsdR は制限（Restriction），エンドヌクレアーゼ
hsdM は修飾（Modification) , メチラーゼ
hsdS はhsdRとhsdM が認識する配列を決定するガイドのようなもの
hsdS の隣には組換え酵素の遺伝子creX があります．
面白いところはcreX の近くにあるhsdS, hsdS', hsdS'' が IRと示されている配列によって組換えがおこりそうだというところです．
HsdS はHsdMがDNAメチル化する配列を決定しています．
hsdS の配列が組換えによって変化することでメチル化モチーフが変化し，肺炎球菌の遺伝子全体の発現を変化させているのではないかと考えられました．
ということでhsdS の配列と遺伝子全体の発現の関係を調べるために，Figure 1 のA～Fに示してあるようにcreX, hsdS', hsdS'' を薬剤耐性遺伝子に組み換え，塩基配列を認識するhsdS が固定された菌株を6株作成しました（Figure 1).
まずA～Fの6株がメチル化している配列を調べるために，一分子シークエンシングをしました．
その結果がTable 1です．
https://www.nature.com/articles/ncomms6055/tables/1
一分子シークエンシングのよって以下のことがわかりました．
- SpnD39IIIABCDEF6つがそれぞれどのような配列を認識，メチル化するのか (Specificity)．
- SpnD39IIIA,B,Eのメチル化モチーフはゲノム上に多く存在する(Difference %)．
- SpnD39IIIのメチル化モチーフはゲノムの片方の鎖状に多く存在する(Strand specificity)．
Strand specifity が偏っているということにどのような意味があるのか
制限修飾系は外来遺伝子の防御に関わっています．
ということで外来遺伝子として以下のプラスミドを使ってStrand specifity の偏りの意義を調べています．
pDP28 をインバースPCRによってSpnD39IIIが認識する配列を変化させた配列を作製しています．
内側と外側に伸びている線がそれぞれ反対の鎖状に乗っているのかを示しています．
これら4つのプラスミドをs.spnD39IIIABCDの4株に導入し，その効率を調べた結果がFigure 2です．
https://www.nature.com/articles/ncomms6055/figures/2
(a,b,c,d)
SpnIIIA,B,C,D それぞれの株にpDP28を導入
それぞれの株からプラスミドを回収し，SpnIIIA,B,C,Dにそれぞれ導入し，得られたコロニー数を比較
SpnIIIB,C はpDP28の形質転換効率が低かった
(e,f)：SpnIIIAのメチル化モチーフが逆鎖上に存在し，SpnIIIBのモチーフが同鎖上に存在するpRMO1はSpnIIIAによる制限を受けやすく，SpnIIIBによる制限を受けにくい
(g)：SpnIIICのメチル化モチーフが同鎖上に存在するpRMO3はSpnIIICによる制限を受けにくい
(h)：SpnIIIDのメチル化モチーフが逆鎖上に存在するpRMO2はSpnIIIDによる制限を受けやすい
異なる鎖状に存在するSpnD39IIIのメチル化モチーフは制限を受けやすいので，
Strand specifity が偏っていることで，自分の遺伝子を守りつつ，外来遺伝子を破壊しやすいという利点があるのではないかと考えられます．
DNAメチル化モチーフの変化が莢膜発現変動に関与している
s.spnD39IIIABCDの4株についてRNAシークエンシングした結果がTable 2です．
https://www.nature.com/articles/ncomms6055/tables/2
SpnD39IIIA,B,C,D それぞれの中期対数増殖期における発現をRNAseqにより解析
SpnD39IIIA,C,Dの発現を1としたときのSpnD39IIIBの発現変動
cps ：莢膜に関係する遺伝子
莢膜に関係する遺伝子がBはA,C,Dと比べて低下していました．
莢膜に関連する表現型，タンパク質量，莢膜成分産生量も変化する
Figure３
(a)：マウスマクロファージ培養細胞の貪食作用に対する抵抗性
(b)：ウエスタンブロッティングによるLuxS タンパク質発現量の比較
(c)：莢膜成分ウロン酸含有量の測定
https://www.nature.com/articles/ncomms6055/figures/3
(a)：SpnIIIBはマウスマクロファージによる貪食を受けやすい
(b)：SpnIIIB,Cは野生株D39と比較してLusXタンパク質の発現量が低い
(c)：SpnIIIBは野生株D39と比較して莢膜成分ウロン酸の含有量が少ない
マウスに対する病原性も変化する
(a,b,c)：経鼻投与(5x104 CFU/10 μL)による鼻咽頭への定着の経時的変化
(d,e)：静脈内投与(1x105 CFU)による血液中の菌数の経時的変化
(f) ：静脈内投与(1x105 CFU) 30時間後の血液中のOpaque colony （莢膜多量産生株）の割合
https://www.nature.com/articles/ncomms6055/figures/4
(a,b,c)：SpnIIIA は鼻咽頭への定着性が低い
(d,e)：SpnIIIBEF は血液中での生存能が低い
(f) ：SpnIIIB は血液中のOpaque colony の割合が低い
実際に野生株は感染部位によってメチル化モチーフを変化させる
(g)：鼻咽頭に定着する野生株D39のSpnD39III hsdS 遺伝子のアレルの割合の経時的変化
(h)：血液に投与した野生株D39株のSpnD39III hsdS 遺伝子のアレルの割合の経時的変化
黒，灰，白，縞はそれぞれ投与0,1,3,7日時点の結果を示しています
https://www.nature.com/articles/ncomms6055/figures/4
(g)：D39株は鼻咽頭中でSpnD39IIIEのアレルの割合が高くなる
(h)：D39株は血液中でSpnD39IIIAのアレルの割合が高くなる
まとめ
S. pneumoniae D39株はSpnD39III のhsdS遺伝子の組換えにより，DNAメチル化モチーフを変化させ，環境に適した表現型へと相変異を起こしている
今回企画を開催していただいたおまつりけばぶ先生，ありがとうございました．
読んでいただきありがとうございました．
12月26日追記
アドベントカレンダーの他の記事を読んでいると，他の方々の研究への愛が伝わってくるような内容だったのに比べて，なんだか私の記事は愛が足らないようなので追記いたします．
まずこの論文では相変異という現象の分子メカニズムの解明を行っています．
相変異とは
Wikipedia によると
という動物から細菌，様々な生物が保有している特徴です．
動物の相変異というとバッタの相変異のことで，（バッタ以外だとガとか？他にもいるのかは知りません）
バッタは餌が豊富な環境ではのんびりとした孤独相という固体同士の接触が起こらないようなおとなしい形態をとります．
一方で餌が乏しい環境では獰猛な群生相という他個体とぶつかり合う群れることを好むような形態をとります．
環境によって適した形態をとることで効率的に生き延びていこうとする戦略です．
一方で細菌の相変異ですが，
例えばサルモネラでは1つの菌株を培養しているとべん毛という細菌の運動に関わる器官の抗原性が異なる1相菌と2相菌の混合状態になります．
この異なる抗原性をもつ細菌の1相から2相への変化は可逆性で，突然変異や復帰突然変異とはことなる現象です．
抗原性を変化させることで，宿主の免疫システムから逃れることで生き延びようとする生存戦略です．（最近は相変異を起こさない単相性のサルモネラが世界中で，家畜に猛威をふるっているらしいので，病原性にはあまり強くは関わっていないのかなと思っていたりします．）
抗原変異のような相変異は細菌だけではなく，トリパノソーマという寄生虫でも見られる現象で，本当にいろいろな生物が相変異を起こします．
この相変異がすごく好きです．
漫画とかアニメで属性を変化させたり，武器を変化させたりするギミックがすごい好きで，それとすごい重なる部分があるというか，わくわくですよね．
実際はバッタの相変異も細菌の相変異もヒトの命に関わるのでわくわくとかいうとあれですが．
今回の論文はその相変異のメカニズムを解明した論文でした．
細菌の相変異は遺伝子内での組換えによって起こるという単純なお話で，
一般的な相変異では組換えを起こした遺伝子の近くの遺伝子の発現を変動させるというものなのですが，
肺炎球菌では一部分の組換えが全体的に変化を引き起こすというもので，とてもおしゃれ？な方法だと思いました．（語彙が足りない）
で，
今回の論文では組換えによって変異するメチル化モチーフを決定する配列は6つであるとして実験を行っています．
実際にはこの6つだけではなく，まったく意味のない組換えも起こっていることがわかっています．
http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1005762
相変異は一定の割合で起こっているとは思うのですが，常にあらゆるパターンの変異が起こっていると，かなり無駄が多いのではないかと思います．
選択圧によるメチル化モチーフの変化だけではなく，なにかトリガーのようなもので変化するような機序があった方が肺炎球菌的に良いのかなと思います．
ただそれがどのような機序によるものなのかはどのようにしたら明らかに出来るのかは全くわかりません．
こんな感じで終わります．
まとまりのないお話でもうしわけないです．
ありがとうございました．
誰にもチェックしてもらっていない文章を公開するの怖すぎる．
